Atlas de Histologia Vegetal e Animal

Resumo médio

Index desta página
1. Simples
2. Misturas

Existem inúmeros fixadores nos manuais de técnicas histológicas. Aqui apenas discutiremos aqueles que consideramos mais comummente utilizados para observação microscópica de tecidos, ou seja, aqueles que melhor preservam a estrutura celular. Os fixadores químicos são os mais frequentemente utilizados, quer compostos de um único tipo de substância fixadora ou com misturas de vários deles.

Os fixadores podem ser classificados em dois grupos principais de acordo com a sua acção sobre o tecido: coagulantes e reticuladores. A primeira, ao extrair água do tecido, produz coagulação e desnaturação de proteínas, especialmente as da matriz extracelular, enquanto que a segunda estabelece ligações químicas entre as moléculas do tecido. Os fixadores à base de álcool são agentes desnaturantes, tais como Bouin ou Carnoy, enquanto que o formaldeído ou o glutaraldeído estabelecem ligações. Também são preparadas soluções mistas de ambos os tipos de fixadores.

Outra classificação de fixadores é se são aditivos ou não aditivos. Os primeiros têm moléculas ou iões que se combinam com moléculas de tecido e tornar-se-ão parte do tecido em etapas de processamento subsequentes. Estes são principalmente os que estabelecem laços e alguns coaguladores. Os não aditivos são aqueles que, depois de desempenharem a sua função, são eliminados em passos subsequentes, como o álcool ou o ácido acético.

p>Cautela! A maioria das substâncias fixadoras são tóxicas por inalação ou contacto, algumas delas cancerígenas. As instruções de segurança de manuseamento e utilização devem ser seguidas.

Simples fixadores

Etanol, metanol, acetona

Etanol
Etanol: CH3-CH2-OH

Fix por desidratação e coagulação de proteínas, especialmente proteínas citosólicas. Removem os lípidos dos tecidos, mas não afectam os hidratos de carbono. O metanol é um fixador melhor do que o etanol porque não causa o mesmo endurecimento do tecido e proporciona uma melhor preservação. Em geral, são bons fixadores para amostras pequenas, e para preservar proteínas, tais como enzimas, glicogénio, e pigmentos. São frequentemente utilizados para fixar esfregaços citológicos ou secções crióticas obtidas a partir de tecido não fixado. Uma vez que desidratam, bem como fixam, também podem ser utilizados como conservante de amostras. Têm algumas desvantagens, tais como produzir endurecimento e retracção de tecidos, muito evidentes em blocos de tecido muito grandes. Falta-lhes o efeito mordente.

Ácido acético

Ácido acético
Ácido acético: CH3COOOH

Não se liga directamente às proteínas mas o seu processo de ligação consiste em alterar o estado coloidal das proteínas. É utilizado numa concentração que varia de 1 a 5%. É o fixador ideal para os ácidos nucleicos e as nucleoproteínas. As suas desvantagens são a destruição das mitocôndrias e a má fixação das membranas e do citoplasma. É frequentemente utilizado em combinação com outros fixadores. Exemplos: Bouin, FAA. Nas misturas fixadoras é também capaz de neutralizar artefactos que podem ser introduzidos por etanol ou ácido pícrico.

Cloreto de zinco ou sulfato de zinco

Cloreto de zinco foi inicialmente utilizado como fixador mas mais tarde tornou-se um componente de misturas fixadoras. É normalmente utilizado em combinação com paraformaldeído. O cloreto de zinco ajuda à fixação e preserva a antigenicidade se o tecido for necessário para testes imunocitoquímicos, contrariando o mascaramento antigénico atribuído ao paraformaldeído. Os sais de zinco têm substituído progressivamente os sais de mercúrio tradicionalmente utilizados nas misturas fixadoras. É importante notar que o fixador não é preparado em sais phostat, como é habitual, e após a fixação o zinco tem de ser removido por lavagem em água destilada.

Ácido pícrico

Ácido pícrico

Ácido pícrico: C6H2OH(NO2)3

Fixação é produzida por sais tipo picrato que coagulam as proteínas do tecido. É normalmente utilizado de 2 a 15% de uma solução saturada de ácido pícrico. Preserva bem a estrutura celular, não produz retracções quando o tempo de fixação é óptimo, preserva bem o glicogénio e os lípidos. É um bom fixador para a coloração geral, pois tem um efeito mordente e favorece a ligação de corantes. Deve ser completamente removida antes de ser incorporada em ceras como a parafina, uma vez que dificulta a penetração da parafina. É frequentemente utilizado em combinação com outros fixadores. Exemplos: Bouin.

Formaldeído

É um fixador amplamente utilizado devido à boa conservação dos tecidos, actua como conservante, produz pouca retracção dos tecidos, é compatível com a maioria das técnicas e manchas histológicas, incluindo a imunocitoquímica e a hibridação do ácido ribonucleico. O formaldeído liga-se a grupos funcionais de proteínas formando grupos hemiacetal. Esta ligação torna muitas enzimas inactivas, o que ajuda a prevenir a degradação dos tecidos por enzimas hidrolíticas. Os grupos a que se liga são grupos amino, sulfidrílico, guanidílico, hidroxílico alifático, e assim por diante. A ligação a um destes grupos produz um grupo de hidroximetileno. É o hidroximetileno que reage com grupos de outra, ou a mesma, proteína para formar pontes. O formaldeído preserva bem os lípidos, especialmente se forem adicionados iões de cálcio à solução fixadora (reduzem a solubilidade dos fosfolípidos), e não reage com hidratos de carbono.

Fixação é normalmente de 24 a 50 h, embora possa ser de 1 a 2 semanas. Se o tecido for destinado à imuno-histoquímica 12-24 h a 4°C é suficiente. A fixação muito prolongada endurece o tecido e pode causar instabilidade dos ácidos nucleicos. Parte do fixador no tecido pode ser removido por lavagem prolongada. Normalmente utilizado em solução tamponada e isotónica. É utilizado em concentrações de cerca de 4%. Actualmente preparado a partir de paraformaldeído, uma substância sólida. Exemplos: formaldeído tamponado, Bouin, FAA, PLP.

Formaldeído
Formaldeído: CH2=O
Formaldeído
Bonds between proteins formed by formaldehydehyde.

Glutaraldeído

Glutaraldeído.
Glutaraldehyde

É um dos fixadores mais utilizados. Em solução polimeriza os dímeros de formação e os acabamentos. Os grupos de aldeídos deixados no interior da molécula polimerizada reagem com os grupos de aminoácidos dos aminoácidos das proteínas, formando pontes entre as moléculas nos tecidos. Os grupos de aldeídos nas extremidades, no entanto, são deixados livres, e é importante cancelá-los para evitar falsos positivos (por exemplo, evitando a ligação de anticorpos durante a imunocitoquímica ou aldheides da ligação de reagentes de Schiff). É portanto boa prática removê-los, o que pode ser feito por incubação em 1 % de boroidrido de sódio. O glutaraldeído tem uma baixa taxa de penetração, pelo que se recomenda a sua fixação por perfusão vascular. É utilizado numa proporção entre 0,5 e 3%. Tem uma alta capacidade de preservar a estrutura celular, uma vez que é capaz de enredar o tecido com mais força do que outros aldeídos, pelo que é o fixador de referência para a observação de ultraestruturas celulares com o microscópio electrónico. Contudo, não é recomendado para a incorporação de parafina, uma vez que torna difícil a obtenção de secções. Deve ter-se cuidado com a sua baixa penetração nos tecidos e pode causar retracção. É utilizado em soluções isotónicas tamponadas e geralmente em combinação com formaldeído.

Atrás da história da histologia, vários tipos de aldeídos têm sido utilizados como fixadores, muitos dos quais já não são utilizados. Por exemplo, hidrato de cloral para o sistema nervoso, acroleína, muito tóxico e utilizado para microscopia electrónica, ou glioxal.

Tetroxido de Osmio

Tetroxido de Osmio
Tetroxido de Osmio. OsO4.
Tetroxido de Ómio
Bonds produzidos por OsO4 nas ligações insaturadas de ácidos gordos.

É um dos fixadores mais antigos, em uso desde pelo menos 1865. Em solução, penetra pouco nos blocos de tecido, e recomenda-se tamanhos não superiores a 0,5 ou 1 mm. Pode ser utilizado tanto em solução como em vapor. Não produz artefactos mas torna as amostras de tecido frágeis. Forma pontes entre as ligações insaturadas das cadeias de ácidos gordos das membranas celulares lipídicas. Torna-os insolúveis, escuros e opacos aos electrões. É por isso que é normalmente utilizado para observações microscópicas electrónicas, uma vez que preserva e escurece as membranas celulares. Mas também em microscopia ligeira é utilizado para estudar as gorduras insaturadas, para observar as vias de mielina, e é necessário para impregnações argênticas, como o método Golgi. Devido ao seu forte carácter oxidante, não é utilizado para coloração convencional, pois impede a ligação de corantes aniónicos ao tecido. É actualmente muito utilizado após a fixação de amostras com formaldeído ou glutaraldeído, e antes da desidratação das amostras para observação microscópica electrónica.

Misturas de fixação

Muitos processos de fixação utilizam várias substâncias fixadoras, misturadas na solução aquosa inicial ou utilizadas sucessivamente ao longo do tempo. Isto tira partido dos benefícios de cada um deles e pode contrariar as suas desvantagens. Há uma multiplicidade de maneiras de utilizar os diferentes fixadores, tanto nos seus componentes como nas suas proporções, dependendo das necessidades subsequentes, ou seja, que tipo de tecido queremos fixar e o que queremos ver desse tecido. Juntamente com as substâncias fixadoras, são também adicionados outros componentes às misturas que afectam outros parâmetros, tais como a osmolaridade ou o pH da solução. Por exemplo, na maioria dos casos, os fixadores são dissolvidos em soluções tampão para controlar a osmolaridade e o pH, de modo a que a estrutura do tecido não seja afectada. Mas também para outros fins, tais como etilenoglicol que é adicionado a fixadores para obter secções de congelação e também evita a difusão de enzimas.

Abaixo mencionaremos algumas combinações frequentemente utilizadas porque têm propriedades de fixação que as tornam adequadas para a observação de uma grande variedade de tecidos e para a utilização de várias técnicas de coloração.

Líquido de Bouin

É formado por ácido pícrico, formaldeído e ácido acético glacial. É uma solução amplamente utilizada para o processamento de tecidos a serem incorporados em parafina (ver capítulo de incorporação) e a cujas secções pode ser aplicado um amplo espectro de manchas. É muito útil para tecidos moles e embriões e preserva bem o núcleo e o glicogénio. Deve ter-se cuidado com o tempo de fixação, que não deve exceder 48 h no caso de fixações por imersão. Após fixação, as amostras de tecido podem ser conservadas em álcool a 70°. Não recomendado para estudos renais e mitocondriais. Antes da incorporação em parafina é aconselhável remover o ácido pícrico por lavagem em álcool a 70° porque impede uma boa incorporação e a coloração não é óptima.

Solução de Clarke

É formada por etanol e ácido acético glacial (3:1). É um dos primeiros fixadores utilizados, bom para amostras a serem incorporadas em parafina.

Carnoy

É um bom fixador para glicogénio, carbohidratos simples e proteínas fibrosas. É bom para visualizar os ácidos nucleicos, embora não a morfologia nuclear, e para os tufos de Nissl do sistema nervoso. Pode produzir retracções teciduais. Consiste em etanol absoluto, clorofórmio e ácido acético glacial.

Misturas com formaldeído

Formaldeído é talvez o fixador mais utilizado actualmente, tanto para técnicas histológicas comuns como para outras como a imunocitoquímica ou a hibridação do ácido nucleico. É mais comummente utilizado numa solução a 4% em conjunto com outros fixadores. É normalmente dissolvido em soluções tampão com uma osmolaridade semelhante à do tecido a ser fixado. Para fixação de tecidos destinados à microscopia electrónica, são frequentemente utilizadas soluções fixadoras contendo formaldeído e glutaraldeído. A função do formaldeído é iniciar uma fixação rápida, devido à sua maior capacidade de penetração, enquanto que o glutaraldeído realizará uma fixação mais poderosa, mas mais lenta, que não afectará a estrutura do tecido, uma vez que o formaldeído já realizou uma fixação anterior. Exemplos: formaldeído tamponado, Bouin, FAA, PLP.

Glutaraldeído-tetroxido de ósmio

Fixativos em combinação não têm necessariamente de ser utilizados ao mesmo tempo. É comum que os tecidos destinados à microscopia electrónica sejam inicialmente fixados em glutaraldeído (1 a 3%) e paraformaldeído (2 a 4%), e depois pós-fixados em 1 % de tetroxido de ósmio em solução tamponada. Este último é um bom conservante da ultra-estrutura celular, especialmente membranas, em cooperação com a aldheides. Isto é importante porque o processo de microscopia electrónica envolve a incubação do tecido em solventes orgânicos e a polimerização da resina a 60 °C, durante a qual o tecido deve ser preservado.

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